Biologia molecular na odontologia: métodos comumente utilizados na cariologia.
Valarinil, N.; Doi, R.K.; Maciel, S.M.; Poli-Frederico, R.C.. Biologia molecular na odontologia: métodos comumente utilizados na cariologia. Odontol. Clín.-Cient., Recife,vol 10 nº(1)pag. 19 - 23, Jan./mar., 2011.
“Apesar de muitos esforços, a carie
dentaria ainda e uma das lesões bucais mais comuns e afeta,
principalmente, jovens e criancas1. Estabelecer a base genética
para esta doença fornecera subsídios para o desenvolvimento
de novas estratégias de prevenção, diagnostico, tratamento,
avaliação de risco e compreensão de sua patogênese.” (p. 1 )
“Diante do intenso desenvolvimento da Biologia Molecular,
o presente trabalho tem como objetivo apresentar ao cirurgião-
-dentista esta promissora ciência e, principalmente, mostrar a aplicação
da tecnologia em genética molecular na prevenção da carie”
dentaria. (p. 4)
“O organismo humano e multicelular, diferentemente
de bactérias que são organismos unicelulares. Enquanto uma
bactéria deve produzir todas as proteínas necessárias para o
seu funcionamento, o corpo humano possui diferenciação celular.” (p. 8 )”
“O controle da expressão gênica
e feito por seqüencia de DNA, que ativam o gene no momento
em que este deve se expressar e na intensidade correta.” (p.9)
“Em 2000, foi anunciada uma versão preliminar do genoma
humano, com aproximadamente 90% de precisão. Em
2003, a versão final do genoma humano foi publicada.” (p.11)
“Os avanços na genética bacteriana surgiram com a descoberta
do código genético, seguida do desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante.” (p.13)
“(...)bioquímicos e
animais implicaram que o Streptococcus mutans é o principal
agente causador da carie dentaria.” (p. 14)
“Apesar de aproximadamente
trezentas espécies bacterianas terem sido associadas
com a placa dentaria, somente a presença do S. mutans tem
sido ligada a formação dessa doença em humanos8” (p. 14)
“(...)pesquisadores já avaliavam
a suscetibilidade genética a carie dentaria por meio de estudos
com gêmeos monozigóticos e dizigoticos.” (p. 16)
“Os resultados
indicaram que gêmeos monozigóticos apresentavam incidência
de carie dentaria similar do que gêmeos dizigoticos e que
os dizigoticos de gêneros diferentes tinham variação maior.” (p. 16)
“(...)outro estudo foi realizado e mostrou
que gêmeos idênticos tinham carie em dentes correspondentes,
entretanto uma analise estatística não foi completada.” (p. 17)
“(...)herança genética tinha participação
na cárie dentaria(...)” (p .17)
“Quatro estudos detectaram um componente genético
na suscetibilidade a carie dentaria e demonstraram que
a carie em gêmeos monozigóticos tinha uma concordância
maior do que nos dizigoticos.” (p. 18)
“Conclusões similares foram verificadas em estudos e que
havia influencia genética na suscetibilidade a carie nas dentições
decídua e permanente.” (p.19)
“Foi sugerido que vários fatores genéticos
podem estar envolvidos no processo da carie dentaria e
na maior similaridade de carie em gêmeos monozigóticos. Tais
fatores são: salivares e da microbiota bucal, tempo e seqüencia
de erupção dentaria, morfologia dentaria, forma do arco dentário,
espaço dentário e propensão a dieta.”(p. 19)
“Inúmeros estudos são realizados, investigando, principalmente,
a contribuição genética a carie dentaria por modificações
no tecido dentário mineralizado no metabolismo, do açúcar, nas funções das glândulas salivares e resposta imune” (p. 21)
“Extração e purificação de ácidos nucléicos: os estudos
genéticos necessitam de ácidos nucléicos íntegros e sem contaminantes
que possam eventualmente prejudicar os testes
moleculares. A extração de ácidos nucléicos pode ser realizada
de varias maneiras, uma vez que muitos protocolos de
extração foram descritos.” (p.22)
“O primeiro passo a ser
realizado e a obtenção do material genético, que pode ser de
células animais, células vegetais, de vírus ou bactérias. Apos a
coleta do material, as células precisam ser separadas. Se estas
forem provenientes de meios de cultura, a separação pode ser
realizada por meio de centrifugação. Quando as células são
obtidas de um tecido, este deve ser homogeneizado. Depois
de as células serem separadas, a etapa seguinte consiste na lise
destes. O método desta ruptura celular varia de acordo com o
tipo de célula, geralmente e realizado por meio de uma enzima,
mas deve ser muito suave para evitar a quebra da molécula de DNA.” (p. 22)
“Eletroforese: e utilizada para visualizar fragmentos
de DNA que são produzidos pela digestão com enzimas de
restrição. Em uma matriz feita de agarose ou poliacrilamida,
os DNAs, quando submetidos a um campo elétrico, em pH
neutro, são atraídos para o polo positivo (anodo) e repelidas
do polo negativo (catodo).” (p. 23)
“Alem do DNA a ser analisado,
também e colocado um marcador de peso molecular que
servira como ponto de referencia, pois forma fragmentos em
pontos específicos e de tamanho diferentes. Normalmente o
marcador usado e o DNA do fago lambda, digerido com uma
enzima de restrição HindIII.” (p. 23)
“No primeiro passo, o
tubo e submetido a uma alta temperatura, normalmente 94°C
por 5 minutos, para que haja ruptura das pontes de hidrogênio
e separação das fitas de DNA. No segundo passo, a temperatura
diminui para 30-65°C por 30 segundos, para que os primers
se anelem as seqüencias complementares no DNA. A ultima
etapa consiste em temperatura em torno de 72°C, durante 2 a
5 minutos, a fim de a Taq DNA polimerase atue, executando a
síntese da nova cadeia. Repetindo-se os passos por cerca de 25
a 30 ciclos, milhões de copias do DNA serao produzidas. A PCR
e um método muito utilizado na identificação de patogenos
associados a carie, placa bacteriana e doença periodontal.”(p. 24)
“Polimorfismos de tamanhos de fragmentos de restrição
(RFLP): o RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) e
um método utilizado na detecção de mutações e polimorfismos
genéticos por meio de enzimas. Com o advento da PCR e
do conhecimento e da disponibilidade das seqüencias de DNA
em bancos genomicos, o método passou a ser utilizado no formato
PCR-RFLP, que permite analisar fragmentos de tamanhos
menores.” (p. 27)
“ Amplificação Alelo Oligonucleotideos-Especifica (PCR-
-ASO): a PCR-ASO (Allele Specific Oligonucleotide Amplification)
e uma adaptação da PCR e também e conhecida como
ARMS (Amplification Refractory Mutation System)46. E um sistema
que permite analise direta de qualquer lócus genético
de interesse e pode ser aplicado para detecção de mutações
genéticas de forma simples, rápida, confiável e de baixo custo.” (p. 28)
“Reação em cadeia da polimerase utilizando primers
arbitrários (Arbitrarily Primed PCR) -AP-PCR: A técnica de PCR,
utilizando primers arbitrários (AP-PCR), consiste em uma variação
da técnica de PCR. E caracterizada pela utilização de
iniciadores de seqüencia arbitraria em ciclos de baixa estringencia,
gerando um padrão de informações altamente ricas e
reprodutíveis de fragmentos de DNA.”(p. 29)
“Microarrays (microarranjos de DNA): nesta técnica, os
fragmentos de genes sao fixados em lamina de vidro ou membranas
de nylon, conhecido também como bioship ou ship
biológico. Uma imagem da hibridização e gerada por meio de leitores a laser ou leitores de fósforo. Tem como finalidade
medir níveis de expressão de genes transcritos em larga escala,
ou seja, esta técnica analisa o perfil do transcriptoma. Por
causa da alta performance desta técnica, e possível avaliar a
expressão diferencial de milhares de genes em somente um
experimento.” (p. 30)
“Checkerboard DNA-DNA hybridization: e uma técnica
da biologia molecular, que verifica o grau de similaridade genética
em seqüencias de DNA e usado para verificar a distancia
genética de duas espécies bacterianas, por exemplo. E
muito utilizado em estudos sobre patologias periodontais ou
para verificação de bactérias do biofilme dental.” (p.31)
“A carie dentaria continua sendo uma doença muito
prevalente na população mundial, mas que pode ser prevenida
ou controlada. Os avanços na biologia molecular e nas
tecnologias geradas nos últimos anos permitiram que novas
abordagens acerca desta e de outras doenças bucais fossem utilizadas.” (p.32)
“(...)importante que o cirurgião-dentista esteja atualizado quanto
as alternativas de métodos de diagnostico existentes atualmente.
Poder saber se o seu paciente tem uma predisposição
genética a desenvolver carie dentaria, problemas periodontais
ou reabsorções radiculares, a partir do DNA das células da
mucosa epitelial da boca(...)” (p.33)
“Existem ainda pacientes que apresentam
fortes fatores de risco para o desenvolvimento da doença
periodontal, como o fumo, ma higiene bucal, acumulo de
calculo gengival e trauma oclusal, embora estejam livres desta doença.” (p.34)
